免疫熒光定量分析儀

免疫熒光定量分析儀--用于人體血液和尿液中的各種分析（CRP、PCT、NT-proBNP、cTnI等)快速準(zhǔn)確地分析含量。光源采用大功率LED燈珠采用窄帶干涉濾光器濾光激發(fā)光和熒光，內(nèi)置光電轉(zhuǎn)換芯片OPT101檢測熒光強(qiáng)度。由立邁生一體化步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動，皮帶驅(qū)動雙排滾珠寬體滑塊在單個(gè)精密直線導(dǎo)軌上滑動，實(shí)現(xiàn)檢測樣品的掃描檢測。通過與標(biāo)準(zhǔn)儀器的比較試驗(yàn)，結(jié)果表明，在小型化、快速、低成本的基礎(chǔ)上，測量結(jié)果準(zhǔn)確，測量精度高，穩(wěn)定性好，能滿足臨床應(yīng)用的要求。

免疫熒光分析技術(shù)是一種新開發(fā)的精密免疫標(biāo)記檢測技術(shù)。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法和金標(biāo)記法相比，免疫熒光分析技術(shù)靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作方便，無放射性物質(zhì)作為標(biāo)記物。因此，它具有無放射性、標(biāo)記物穩(wěn)定、易于長期保存、試驗(yàn)重復(fù)性好、分析速度快、樣品用量少、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬等優(yōu)點(diǎn)[1]。熒光分析法是確定物質(zhì)吸收一定頻率的光后發(fā)射的光的強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度與物質(zhì)數(shù)量成正比，可以通過確定熒光光譜和熒光強(qiáng)度來定性或定量分析物質(zhì)。免疫熒光分析技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常用的快速分析技術(shù)，在微生物、病毒抗原或抗體檢測、激素檢測、腫瘤標(biāo)志物檢測、藥物 ** 、 ** 、 ** 、 ** 等檢測領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。

免疫熒光定量檢測原理

特殊的熒光抗體首先固定在硝酸纖維素膜的某個(gè)區(qū)域。當(dāng)干燥的硝酸纖維素一端滴入樣品時(shí)，由于毛細(xì)管的作用，樣品將沿著膜向前移動。當(dāng)移動到固定的抗體區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原與熒光體特異性結(jié)合。隨著進(jìn)一步的分析，用這種抗原的另一種抗體捕捉復(fù)合物，多余的熒光抗體用第二種抗體捕捉。（C線)和檢測線（T線)。當(dāng)光源照射到檢測卡上時(shí)，質(zhì)量控制線和檢測線分別刺激不同強(qiáng)度的熒光。光電轉(zhuǎn)換器接收不同強(qiáng)度的熒光，產(chǎn)生不同大小的電信號。電信號的強(qiáng)度反映了待檢測對象的濃度，從而實(shí)現(xiàn)了特定的免疫診斷。

2 設(shè)計(jì)免疫熒光定量分析儀系統(tǒng)

免疫熒光定量分析儀主要由光學(xué)、硬件電路和系統(tǒng)軟件組成。光學(xué)部分是熒光定量分析儀的核心部分，用于激發(fā)熒光，而硬件電路部分和系統(tǒng)軟件部分用于檢測和控制整個(gè)儀器的正常運(yùn)行。

2.1 光學(xué)設(shè)計(jì)

如圖1所示，光學(xué)部分由光源發(fā)射光路和熒光檢測光路組成。

光源發(fā)射光路由LED由光源、凸透鏡1、濾光片1和凸透鏡2組成。LED光源的光軸與凸透鏡1、濾光片1、凸透鏡2的光軸在一條線上。光源為綠色(中心波長580 nm)高亮度LED光源，LED位于發(fā)射光路凸透鏡1的焦點(diǎn)，使光源發(fā)出的光通過凸透鏡1變成平行光，濾光片1采用中心波長580 nm帶寬為30 nm窄帶干涉濾光片，平行光通過濾光片1，進(jìn)入射光565 nm～595 nm范圍以外的光被濾除掉，出射的光為窄帶光(565 nm～595 nm)，凸透鏡2后，聚焦在樣品上，激發(fā)熒光，熒光波長為610 nm。

熒光檢測光路由凸透鏡3、濾光片2、凸透鏡4和光電轉(zhuǎn)換器組成。光電轉(zhuǎn)換器與凸透鏡3、濾光片2、凸透鏡4的光軸在同一條線上。熒光檢測光軸和發(fā)射光軸為45°角度較大限度地減少了激發(fā)光對熒光信號檢測的影響。熒光檢測光路光軸與發(fā)射光路光軸的交點(diǎn)在試紙上，交點(diǎn)為凸透鏡2和凸透鏡3的焦點(diǎn)。濾光片2采用中心波長610 nm，帶寬為15 nm窄帶干涉濾光片。激發(fā)的熒光被凸透鏡3收集成平行光。平行光通過濾光片2后，濾光片將過濾掉原來的少量激發(fā)光，只剩下610 nm大約熒光信號通過[2-3]。在熒光檢測模塊上聚焦的光電轉(zhuǎn)換器上，通過濾光片后的光被凸透鏡4收集，實(shí)現(xiàn)光信號向電信號的轉(zhuǎn)換。

2.設(shè)計(jì)2 系統(tǒng)硬件電路

系統(tǒng)硬件電路的結(jié)構(gòu)框圖如圖2所示。儀器的測量原理是通過發(fā)光控制模塊將待檢測樣本驅(qū)動到檢測器檢測口上方LED發(fā)光強(qiáng)度符合測量強(qiáng)度要求，光電傳感器檢測熒光信號的強(qiáng)度，放大濾波后輸出信號進(jìn)入ADS1252將數(shù)字信號轉(zhuǎn)換為處理器[4]。

圖2中檢測器框中顯示的部分包括上述2.1描述的光學(xué)部分和部分硬件電路共同包裝在探測器中，提高了檢測信號的穩(wěn)定性和抗干擾性。探測器的硬件電路由發(fā)光控制模塊和熒光檢測模塊組成。

為保證光源的穩(wěn)定性，發(fā)光控制模塊采用恒流源驅(qū)動模式，可有效保證光源發(fā)光強(qiáng)度的恒定。對于某些樣品，照射光源不應(yīng)太強(qiáng)。因此，恒流源采用程序控制調(diào)節(jié)的恒流源，可通過輸入不同的數(shù)字值進(jìn)行控制LED發(fā)光強(qiáng)度LED程序可以控制驅(qū)動電流的大小。

光電轉(zhuǎn)換器選用內(nèi)置光電轉(zhuǎn)換芯片OPT101。熒光檢測模塊包含了光電轉(zhuǎn)換、信號放大濾波、電壓偏置、模/數(shù)轉(zhuǎn)換等部分。其中，信號放大采用程控放大，模/數(shù)轉(zhuǎn)換采用24位的A/D轉(zhuǎn)換芯片ADS1252可以保證足夠的轉(zhuǎn)換精度和較大的動態(tài)檢測范圍。數(shù)字電信號傳輸給控制器，比模擬信號具有更強(qiáng)的抗干擾性和準(zhǔn)確性，大大提高了系統(tǒng)的檢測精度。

2.3 系統(tǒng)軟件部分設(shè)置

使用系統(tǒng)軟件C編寫語言，軟件流程圖如圖3所示。系統(tǒng)初始化主要完成系統(tǒng)外圍模塊的配置和歷史設(shè)置的讀取和配置。系統(tǒng)初始化完成后，控制電機(jī)驅(qū)動樣品卡槽離開倉庫，并提示用戶在顯示屏上插入檢測樣品卡。系統(tǒng)循環(huán)檢測樣品卡是否插入卡槽。當(dāng)檢測到樣品卡插入時(shí)，系統(tǒng)打開二維碼掃描槍，控制電機(jī)驅(qū)動樣品卡移動到掃描槍讀取二維碼。二維碼包括檢測項(xiàng)目、產(chǎn)品批號、標(biāo)準(zhǔn)曲線等信息。系統(tǒng)判斷二維碼信息有效后，打開LED并根據(jù)二維碼相關(guān)信息進(jìn)行調(diào)整LED亮度控制電機(jī)驅(qū)動待檢測樣本移動到檢測器上方進(jìn)行檢測。收集到的數(shù)據(jù)將是txt保存文件的形式SD卡內(nèi)，通過一定的算法計(jì)算T線與C與二維碼信息中的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，線對應(yīng)峰值的面積得到待檢測樣品的濃度，并在顯示屏上顯示較終熒光強(qiáng)度曲線和樣品的濃度檢測結(jié)果，并自動存儲和打印檢測信息[5]。

3 測試結(jié)果及分析

本文設(shè)計(jì)的免疫熒光定量分析儀可以測量血液和尿液中各種物質(zhì)的濃度NT-proBNP（N末端腦鈉肽前體的濃度測量是對儀器運(yùn)行效果的分析。NT-proBNP它是一種由心臟分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素 ，已被證明是心力衰竭患者臨床診斷、治療和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)[6]。

3.采集1 熒光信號

將樣品卡插入儀器卡槽中檢測熒光強(qiáng)度曲線，如圖4所示。圖中的水平坐標(biāo)代表數(shù)據(jù)數(shù)量，垂直坐標(biāo)代表光電轉(zhuǎn)換器輸出的電壓值，單位為mV。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)直線擬合

獲得樣品熒光強(qiáng)度曲線后，可以用高斯擬合計(jì)算T線和C利用線對應(yīng)的曲線峰面積T線和C線對應(yīng)峰值的面積可以計(jì)算樣品的濃度。這需要一組標(biāo)準(zhǔn)濃度驗(yàn)證產(chǎn)品，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度驗(yàn)證產(chǎn)品的測量結(jié)果建立一定的數(shù)學(xué)模型來計(jì)算T線和C線對應(yīng)峰面積與樣品濃度的數(shù)學(xué)關(guān)系。

樣品濃度和樣品濃度按標(biāo)準(zhǔn)濃度驗(yàn)證T線對應(yīng)峰面積(使用AT表示）與C線對應(yīng)峰面積(使用AC表示）之比AT/AC如表1所示。

較小二乘法通過表1中的對應(yīng)關(guān)系獲得的樣品濃度和AT/AC如圖5所示，數(shù)學(xué)量化關(guān)系。

從圖5乘法擬合直線的表達(dá)式如圖1所示：

y=9 912.156x-84.742 8(1)

直線擬合相關(guān)系數(shù)R=0.999 92表明這六種標(biāo)準(zhǔn)濃度校準(zhǔn)產(chǎn)品的濃度和濃度AT/AC線性關(guān)系很好。

3.3 系統(tǒng)測量誤差分析

選擇一組相同批次的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)濃度樣品，根據(jù)1測量樣品濃度，分析系統(tǒng)的檢測誤差，測量結(jié)果如表2所示

由表2的實(shí)測結(jié)果可以看出，對于標(biāo)準(zhǔn)濃度樣品的測量誤差在±8%以內(nèi)，滿足實(shí)際使用要求。以下是一組醫(yī)院患者的血液樣品，以進(jìn)口銳普智能熒光干式定量分析儀為標(biāo)準(zhǔn)儀器進(jìn)行對比測量。每例75 L將樣品緩沖液中加入病人的血樣，將溶液充分混合，取75 滋L樣品滴加入樣品卡加樣孔，等待15 min將樣品卡插入儀器卡槽后得到的測量結(jié)果如表3所示.

由表3的對比測量結(jié)果可以看出，本文設(shè)計(jì)的免疫熒光定量分析儀與現(xiàn)已商品化的免疫熒光檢測儀相比，測量誤差在±能滿足臨床應(yīng)用要求的8%以內(nèi)。

4 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)了免疫熒光定量分析儀，詳細(xì)介紹了儀器的光學(xué)、硬件電路和系統(tǒng)軟件。從多個(gè)角度分析了儀器的運(yùn)行結(jié)果。從測試結(jié)果可以看出，儀器可以擬合出線性好的標(biāo)準(zhǔn)直線。通過對標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證產(chǎn)品的測量試驗(yàn)和與標(biāo)準(zhǔn)儀器的比較試驗(yàn)，表明儀器可以在小型化、快速性的基礎(chǔ)上控制測量誤差±能滿足臨床應(yīng)用要求的8%以內(nèi)。